合成染料根據其結構可分為偶氮類、蒽醌類、雜環(huán)類、酞菁類等,應用于紡織印染、造紙、皮革、化妝品、制藥等行業(yè).在印染行業(yè)使用的染料就超過1000種,全球每年的染料使用量估計高達800000 t,其中的10%~15%在染色過程中隨著廢水排出;許多染料有致突、致癌毒性,而且結構復雜,市政污水系統(tǒng)的好氧處理難以對印染廢水進行脫色;吸附、絮凝、離子交換、超濾、電化學、化學氧化、光催化氧化等物理化學方法可以對印染廢水進行脫色,但成本較高.近年來微生物酶法脫色作為一種環(huán)境友好技術受到廣泛關注.
漆酶是一種含有銅離子的多酚氧化酶,它能催化多酚、木質素、氨基苯酚、多胺、芳基二胺等多種芳香族、非芳香族化合物發(fā)生氧化反應.它催化的特點就是使氧分子還原成為水,同時底物所形成的自由基可以自身結合或者相互偶聯(lián),形成聚合物或偶聯(lián)物,而不產生其他物質(劉濤等,2005),因此漆酶的優(yōu)點在于其催化染料脫色時不產生新的有害產物,是一種環(huán)保用酶.能夠產生漆酶的物種有很多,包括動物、植物、細菌、真菌等,其中利用白腐真菌生產漆酶被認為最具前景,Ganoderma lucidum分泌的漆酶具有耐熱性好、最適pH偏酸、脫色效率高等特點.
紡織印染廢水中成分復雜,含有多種染料、紡織助劑、鹽類、表面活性劑、紡織品降解物等,而目前漆酶脫色研究主要集中于對單種染料的降解.酸性黑ATT(圖 1)屬于一種復合的偶氮染料,由酸性黑10B和酸性橙Ⅱ按照70 ∶ 30比例調合而成,常用于毛、絲、棉綸及其混紡織物的染色,是一種代表性的復合染料.本研究利用Ganoderma lucidum wz-32所產漆酶催化酸性黑ATT脫色的條件,同時考慮到漆酶的催化作用會受到金屬離子、酶抑制劑和催化助劑的影響,研究了一些金屬離子和化學試劑對脫色的影響,以期為漆酶在復合染料廢水脫色處理領域的深入研究及工業(yè)化應用提供基礎.
圖 1 酸性黑ATT染料組成及分子結構
2 材料與方法
2.1 染料
酸性黑ATT(Acid Black ATT),購自溫州市化工市場.
2.2 化學試劑
ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、HBT(1-羥基-苯并-三氮唑),購自Sigma公司;磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸銅、氯化鈷、硫酸鈉、硫酸亞鐵、氯化錳、碘化鉀、EDTA-鈉(乙二胺四乙酸二鈉)、SDS(十二烷基硫酸鈉)等試劑均為市售分析純.
2.3 漆酶的制備
將白腐菌Ganoderma lucidum wz-32(溫州大學發(fā)酵工程實驗室保存)接種于150 mL種子培養(yǎng)基(葡萄糖2%,玉米粉2%,豆粕2%,硫酸鎂0.075%,磷酸氫二鉀0.15%,水)在28 ℃、165 r · min-1搖床培養(yǎng)7d.將種子液按10%的接種量接種于發(fā)酵罐中,28 ℃液體發(fā)酵培養(yǎng)5d(培養(yǎng)基:可溶性淀粉2%,花生殼3%,豆粕1.5%,硫酸鎂0.075%,磷酸氫二鉀0.15%,硫酸銅0.01%,水).發(fā)酵結束后5000 r · min-1離心條件下取上清液即為粗酶液,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?
2.4 酶活性的測定
反應總體系3 mL,含0.1 mL經稀釋的酶液,1.9 mL pH 3.0的緩沖液(檸檬酸-磷酸氫二鈉)和1.0 mL 0.5 mmol · L-1 ABTS溶液.50 ℃水浴保溫3 min,420 nm處測定吸光值.每min氧化1 μmol底物(ABTS,吸光系數(shù)為36000 L ·(mol · cm)-1)所需要的酶量為1個酶活單位(U).
2.5 染料最大吸收光譜的測定
用蒸餾水把酸性黑ATT配成0.1 g · L-1的母液,測定時將溶液稀釋到線性范圍內,以蒸餾水為參比,進行光譜掃描得到酸性黑ATT的最大吸收波長為636.00nm.
2.6 染料的脫色試驗和脫色率的計算
在20mL的反應體系中,用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調整脫色體系的pH,控制變量法依次改變脫色pH、時間、溫度、酶活、染料濃度進行試驗.分別測定脫色前后的吸光值(A),脫色率的計算公式(Khlifi et al., 2010):
式中,A0、A分別表示初始時刻和t時刻染料在最大吸收波長下的吸光值.實驗重復3 次,取平均值.
2.7 正交優(yōu)化試驗
為確定漆酶催化酸性黑ATT脫色的最佳條件,對加酶量、pH、溫度、染料濃度進行正交優(yōu)化試驗,選用L9(34)正交表安排試驗,各因素的試驗水平根據單因素的試驗結果確定,具體見表 1.
表1 正交試驗設計因素水平
3 結果與討論
3.1 時間對脫色效果的影響
在pH 5.0、加酶量6 U · mL-1、溫度為60 ℃、染料濃度0.1 g · L-1時,分別在保溫5、10、20、30、40、50、60、70、80 min時取樣,測定脫色率.結果(圖 2)表明隨著時間的延長,染料溶液的脫色率變化先快后慢,在反應的前20 min,其脫色率變化是最快的,20 min后其脫色率變化越來越小,60 min以后脫色率變化不大.隨著時間的延長,酶與染料中的成分已經充分接觸并使之脫色,60 min后體系中的染料濃度較低,不利于與酶活性中心結合,所以確定脫色時間為60 min進行后續(xù)試驗.
圖 2 漆酶催化酸性黑ATT脫色隨時間的變化
3.2 pH對脫色效果的影響
在加酶量6 U · mL-1、溫度60 ℃、染料濃度0.1 g · L-1條件下,分別調節(jié)緩沖液pH為3、4、5、6、7、8,保溫60 min.研究pH對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響,結果(圖 3)表明,當pH為3~8時,隨著pH的增大,脫色率呈先上升后下降的趨勢,pH為5時脫色效果最好.pH是影響酶活的主要因素之一,對酶活的影響關系到酶作用于染液的效果,而漆酶的酶活在偏酸的環(huán)境中較高,在酸性條件下有利于漆酶催化酸性黑ATT脫色.G.lucidum所產漆酶適應的pH范圍較寬,在pH 4.0~7.5酶活穩(wěn)定,pH 4.0對偶氮染料Remazol Black-5和蒽醌染料Remazol Brilliant Blue R的脫色效果最好.
圖 3 pH對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
3.3 溫度對脫色效果的影響
在pH 5.0、加酶量6 U · mL-1、染料濃度0.1 g · L-1條件下,分別設定溫度為40、50、60、70 ℃,保溫60 min.研究溫度對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響,結果(圖 4)表明,在40~60 ℃范圍內,脫色率變化不大,脫色率最高可達81%.G. lucidum所產漆酶為耐熱性酶,在60 ℃時的半衰期為2 h,4 h后殘存酶活為25%,但70 ℃時酶活快速下降,本研究結果與之相一致,當溫度為70 ℃時,脫色率明顯減小,因為溫度過高會導致酶蛋白變性,使酶的活性大幅下降,導致脫色率降低.
圖 4 溫度對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
3.4 酶量對脫色效果的影響
在pH 5.0、溫度60 ℃、染料濃度0.1 g · L-1條件下,分別加入3~30 U · mL-1酶量,保溫60 min,研究加酶量對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響.結果如圖 5所示,在小于6 U · mL-1的酶活范圍內,隨著加酶量的增加,脫色率與加酶量成正相關,隨著酶的增多,反應活性中心增多,有利于與底物的結合從而提高脫色的效率,加酶量在6 U · mL-1時脫色率為84.62%,但繼續(xù)增加酶量并不能進一步顯著提高脫色率,這一結果與Murugesan等的結果相一致.
圖 5 加酶量對酸性黑ATT脫色的影響
在pH 5.0、加酶量6 U · mL-1、溫度60 ℃條件下,分別添加濃度為0.05、0.10、0.15 g · L-1、0.20、0.25、0.30 g · L-1的酸性黑ATT染料,保溫60 min,比較一定量的酶液脫色的染料濃度限度.如圖 6所示,在染料濃度為0.05~0.30 g · L-1時,脫色效果呈下降趨勢,但脫色率相差不大,都在80%以上,表明G. lucidum wz-32所產漆酶能耐受較高濃度的酸性黑ATT染料.提高染料濃度在前期脫色率較低,但隨著反應時間的延長,脫色率會逐漸上升,偶氮染料Remazol Black-5和蒽醌染料Remazol Brilliant Blue R在0.3 g · L-1濃度下對漆酶沒有抑制作用.酸性黑ATT中含有磺酸基(—SO3),磺酸基對染料的生物降解有一定的抑制作用.
圖 6 染料濃度對酸性黑ATT脫色的影響
3.6 正交試驗優(yōu)化
對加酶量、pH、溫度、染料濃度4個因子進行正交試驗優(yōu)化,結果(表 2)表明,對脫色率影響大小依次為C>B>D>A,即溫度>pH值>染料濃度>加酶量,最優(yōu)組合為A3B2C2D1,所對應的最佳條件為:加酶量9 U · mL-1、反應pH 5.0、溫度為50 ℃、染料濃度為0.1 g · L-1.在此條件下進行驗證性試驗得到的脫色率為87.35%.
表2 酸性黑ATT脫色的正交實驗結果
3.7 金屬離子對脫色效果的影響
紡織廢水中往往含有Cu2+、Co2+、Zn2+、Na+等金屬離子,為探究各離子對脫色效果的影響,在正交試驗所得的最優(yōu)條件下分別添加氯化鈷、硫酸鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、氯化錳、硫酸銅、氯化鈣、氯化鉀、碘化鉀,濃度分別為0、0.5、1、5、10 mmol · L-1.結果表明,對脫色作用具有促進作用的離子有:Na+、Mg2+、Cu2+,但在試驗范圍內促進作用不顯著;具有抑制作用的離子有Co2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、I-(圖 7),10 mmol · L-1的濃度可使脫色率降低50%以上;其中Mn2+的抑制作用尤為顯著,0.5 mmol · L-1的濃度就使脫色率減小50%以上.通過KCl和KI的比較試驗,可以看出,I-濃度為10 mmol · L-1時脫色率只有17.01%,具有很強的抑制作用,因為I-可以抑制酶活,從而降低脫色率.
圖 7 不同離子對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
銅離子在濃度小于1 mmol · L-1時,對脫色略有促進作用,而隨著銅離子濃度的上升,脫色率明顯下降.Cu2+是漆酶的組成部分,也是其活性中心,適量的Cu2+對漆酶的活性有促進作用.但是高濃度銅離子卻會起反作用,因為高濃度離子對染料本身的色澤起了加深作用.
3.8 酶抑制劑對脫色效果的影響
EDTA-鈉是一種絡合劑能夠與金屬陽離子形成高度穩(wěn)定的水溶性絡合物,EDTA-鈉能夠與漆酶的銅離子結合,從而改變漆酶的活性結合位點;SDS是一種離子型去污劑,可使蛋白質變性.在正交試驗所得的最優(yōu)條件下,分別加入0、0.1、0.5、1、10 mmol · L-1的EDTA-鈉、SDS,探究酶抑制劑對脫色率的影響.結果(圖 8)表明,EDTA-鈉對脫色的抑制作用不顯著,加入量達10 mmol · L-1時才顯現(xiàn)一定的抑制效果.SDS對脫色的抑制作用很強,濃度為10 mmol · L-1時脫色率降低了68%.
圖 8 酶抑制劑對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
3.9 助劑對脫色效果的影響
分別在脫色體系中加入0、0.1、0.5、1.0 μmol · L-1 濃度的ABTS,0、0.5、1、5、10 mmol · L-1濃度的HBT,探究脫色助劑對脫色率的影響.結果(圖 9、10)表明,在試驗范圍內ABTS對脫色影響不顯著;但HBT效果顯著,室溫下加入1 mmol · L-1 HBT反應10 min,其脫色率可達到對照組(50 ℃)反應60 min時的脫色率(87.35%),顯著提高了漆酶的脫色效率.HBT是良好的氧化還原介質,在漆酶催化染料脫色、紙漿漂白及其它污染物降解過程中起著重要作用的研究表明HBT是Pleurotus sajor-caju和G. lucidum所產漆酶脫色的最佳助劑.漆酶-HBT介質系統(tǒng)對降 解Acid Red 1、Reactive Black 5、reactive red 239、reactive yellow 15、reactive blue 114等染料非常有效. HBT濃度為1.0 mmol · L-1時效果最佳(脫色率可達90.81%),濃度大于1.0 mmol · L-1以后促進作用反而降低(圖 10),因為HBT超過一定濃度時,其形成的自由基對漆酶的酶活有抑制作用.具體參見污水寶商城資料或http://www.dowater.com更多相關技術文檔。
圖 9 ABTS對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
圖 10 HBT對漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
4 結論
1)溫度、pH、加酶量、染料濃度這4個因素對漆酶催化復合染料酸性黑ATT脫色的效果有顯著影響.通過正交試驗確定最優(yōu)脫色條件為酶活9 U · mL-1、pH 5.0、溫度為50 ℃、染料濃度為0.1 g · L-1,在此條件下的脫色率為87.35%.
2)實驗證明G. lucidum wz-32粗酶液可以對偶氮染料進行直接脫色,無需加入介質,可能是未純化的粗酶液中有充當介質的未知小分子物質.
3)金屬離子Co2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、I-對G.lucidum wz-32漆酶脫色有抑制作用,Mn2+和I-尤其明顯;Na+、Mg2+、Cu2+對脫色有一定的促進作用.酶抑制劑和脫色助劑的實驗表明,EDTA-鈉對脫色的抑制作用不顯著,而SDS的抑制作用非常顯著;HBT對脫色的促進作用顯著,是非常有效的脫色助劑.